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          mRNA制備解決方案

          發布時間: 2021-06-04  點擊次數: 296次

          mRNA疫苗在covid-19疫情出圈后,基于mRNA開發新療法更加受到關注,包括mRNA傳染病疫苗、腫瘤免疫療法(癌癥疫苗)、治療性蛋白質替代療法和遺傳疾病治療等。 

          基于mRNA技術的covid-19廣泛使用。目前,全球范圍內已有2種mRNA疫苗獲得FDA的EUA(緊急使用授權),分別是由德國BioNTech、輝瑞和復星醫藥共同研發的BNT162b2(有效率95%)以及美國Moderna公司研發的mRNA-1273(有效率94.1%)。

          在國內,由沃森生物、蘇州艾博生物、軍事科學院軍事醫學研究院共同研制的mRNA covid-19ARCoV將于5月30日起在墨西哥開始III期試驗;斯微生物的mRNA疫苗也進入了I期臨床試驗。

          既然mRNA疫苗這么受歡迎,今天我們就來講講mRNA疫苗是如何體外制備的。

          mRNA疫苗的制備

          covid-19為例,我們首先分離出病毒株,測序及分析獲得病毒的完整基因序列,然后通過基因工程技術,利用化學合成的方式,合成S刺突蛋白所對應的病毒RNA片段,為了方便接下來的RNA大量復制,RNA片段首先在DNA聚合酶的作用下,發生逆轉錄合成雙鏈DNA結構。在基因克隆技術中,通常將要復制的DNA嵌入到載體質粒中,利用細菌快速繁殖,培養,復制出大量嵌入S蛋白DNA質粒的細菌,經過提取,分離,純化等工藝,得到大量純凈S蛋白DNA。S蛋白DNA通過使用轉錄試劑完成體外轉錄得到大量mRNA,mRNA單獨存在時結構并不穩定,所以在最終制成疫苗時,需要在mRNA外層包裹一層脂類,最終完成mRNA疫苗的制備。

          mRNA的結構及優化策略

          1 mRNA加帽

          真核細胞mRNA的5'端有一個帽子結構,它是在mRNA轉錄后,由甲基化的鳥苷酸(m7G)經焦磷酸化與mRNA的5'端核苷酸相連。5'端帽子結構在mRNA許多生物學功能中起到重要的作用,這包括:mRNA的剪切、穩定、轉運和核糖體的募集等。由于5'端帽子結構的重要生物學功能,在mRNA疫苗研發過程中需要優化5'端帽子結構,并利用合適的工藝對mRNA原料進行“加帽”。

          mRNA疫苗產品的加帽可以在mRNA的體外轉錄過程中通過摻入“帽子序列”實現,這種加帽技術會將加帽序列反向加在mRNA上,這會導致約1/3的加帽失敗。通過摻入特殊的帽子結構——“anti-reverse”帽子結構(ARCA)可以降低這種反向加帽失誤的出現。另外,還可以先合成不帶帽子結構的mRNA,再利用痘病毒的“加帽復合物”對mRNA進行加帽,這也是一種mRNA的加帽手段。

          2.非翻譯區序列(UTRs)修飾

          在mRNA的編碼區兩端各存在一段非翻譯區(UTRs),在5'端的被稱為5'端UTR,在3'端的被稱為3'端UTR。

          非翻譯區序列不是密碼子,不能翻譯成氨基酸,但是可以通過RNA結合蛋白控制mRNA產品的降解和轉錄效率。因此,每一種mRNA疫苗都需要考慮如何設計產品的UTR組件,進而提高在目的細胞中mRNA疫苗的穩定性和轉錄效率。大量的研究發現非洲爪蟾和人源的α-球蛋白/β-球蛋白的UTR序列非常穩定,而且能夠增加異源的mRNA的表達效率,因此這兩個蛋白的UTR原件通常被設計為mRNA疫苗的UTR組件。當然,也有其它蛋白的UTRs被研究用于mRNA疫苗的組件,在此不再贅述。

          3.Poly(A)

          大多數真核生物的mRNA 的3'端都有由100~200個腺苷酸聚合形成的Poly(A)尾巴。mRNA的Poly(A)尾巴可以和5'端帽子結構共同合作,增強mRNA結構的穩定性。Poly(A)尾巴首先和大量的Poly(A)結合蛋白(PABP)結合,然后募集真核生物起始因子4G(eIF4G),增加Poly(A)跟5'端帽子結構的親和力,最終mRNA的Poly(A)尾巴和5'端帽子結構首尾相接,形成環裝mRNA。環裝mRNA結構有利于核糖體的募集,其特殊的結構也能保護mRNA不被降解。

          在mRNA體外合成過程中,Poly(A)尾巴可以通過質粒DNA模板轉錄獲得,也可以先合成mRNA再通過Poly(A)聚合酶加上不同單位數量的尾巴。前者能夠在mRNA產品中加入特定數目的Poly(A),而后者加入的單位數不確定。

          Poly(A)尾巴的單位數目對于其生物學作用起到了至關重要的作用。在哺乳動物細胞內,活躍表達的mRNA包含的Poly(A)序列的長度為100-250個。有研究發現,表達效率越高的mRNA,其Poly(A)尾巴越短。但是當Poly(A)單位長度小于12時,mRNA結構就不再穩定,容易被降解。在設計mRNA疫苗產品的序列時,Poly(A)的長度也是非常重要的優化指標。

          4. 開放閱讀框

          開放閱讀框(Open Reading Frame, ORF)包涵了mRNA的全部編碼序列,負責進入人體后表達mRNA運載的抗原靶蛋白。

          密碼子水平的修飾,利用常用的密碼子,選用tRNA較多的密碼子;使各個密碼子的比例更接近靶物種或者細胞的比例;

          GC含量的修飾,避免復雜二級結構形成;二級結構對mRNA的延伸和轉錄非常重要,高穩定的二級結構和發夾結構需要避免。這樣的二級結構可以阻止核糖體的進入、掃描以及容易被先天性免疫識別為PAMP。

          mRNA疫苗制備試劑盒:

          Cellscript   T7 mScript™ Standard mRNA Production System  C-MSC11610/C-MSC100625

          該試劑盒包含T7 RNA聚合酶,加帽酶,加尾酶,以及2'-O-甲基轉移酶, 可以一站式解決mRNA制備過程。

          T7-FlashScribe™ Transcription Kit  C-ASF3507  1ug線性化的DNA為模板,在30min內體外轉錄可以得到180ugRNA。

           

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          貨號

          品牌

          T7-FlashScribe Transcription Kit

          C-ASF3507

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          北京和一生物作為Cellscript的國內授權代理,為你提供CellScript公司全套的mRNA生產的原料,目前產品主要包括體外轉錄試劑盒,帽類似物,加帽酶,加尾酶,以及一些修飾核苷等等,北京和一生物為你提供全套mRNA制備的解決方案,助力抗擊covid-19,期待你的咨詢!

           

           

           

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